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本生帶您了解:ELISA實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)問(wèn)題和注意事項(xiàng)
更新時(shí)間:2023-12-19瀏覽:715次

  本生帶您了解:ELISA實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)問(wèn)題和注意事項(xiàng)
 

  用于ELISA測(cè)定的臨床標(biāo)本最為常用的是血清(漿)。本實(shí)驗(yàn)室用ELISA測(cè)定乙肝兩對(duì)半,甲肝,戊肝,抗HIV的標(biāo)本時(shí),在處理和保存方面要考慮以下幾個(gè)方面:

  1)要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血及血清中混有紅細(xì)胞。當(dāng)標(biāo)本出現(xiàn)嚴(yán)重溶血及血清中混有紅細(xì)胞時(shí),反應(yīng)孔不易洗凈,殘留在反應(yīng)孔內(nèi)的血紅蛋白具有過(guò)氧化物酶的活性,顯色時(shí)可能造成假陽(yáng)性。

  2)標(biāo)本凝固不全強(qiáng)行離心,造成血清中含有少量的纖維蛋白原,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中形成纖維蛋白吸附在反應(yīng)孔孔壁上不易洗掉,易造成假性結(jié)果。

  3)血清標(biāo)本可在2~8℃下保存1周。如血清樣本需長(zhǎng)時(shí)間保存,則需放入-20℃冰柜內(nèi)冰凍保存。冰凍保存的血清標(biāo)本須注意避免反復(fù)凍融,標(biāo)本可能引起假陰性結(jié)果。此外凍融標(biāo)本的混勻不要進(jìn)行劇烈振蕩,應(yīng)反復(fù)顛倒混勻。

  ELISA測(cè)定中試劑準(zhǔn)備:

  在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,將試劑盒先從冰箱中拿出來(lái),在室溫下放置20分鐘以上后,再進(jìn)行測(cè)定,證試劑盒溫度要和室溫一致。如果把試劑盒從冰箱拿出來(lái)直接做實(shí)驗(yàn)會(huì)造成一些弱陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性。因?yàn)樵诤竺娴姆跤磻?yīng)步驟中,造成孵育時(shí)間不夠。其次,ELISA實(shí)驗(yàn)中洗板用的洗液需每日更換配制,稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。


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  加血清樣本及反應(yīng)試劑:

  血清樣本使用微量加樣槍加樣。使用微量加樣槍加樣必須注意避免以下幾點(diǎn):

  1)加樣太快,無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。需勻速加樣,吸樣時(shí),加樣槍需按到第一檔,加樣時(shí),加樣槍需直接按到底。

  2)加樣應(yīng)直接加入反應(yīng)孔底部,加在反應(yīng)孔孔壁上易濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。盡量避免出現(xiàn)氣泡。

  3)反應(yīng)試劑的加入時(shí)先要注意試劑的有效期,再注意滴加的角度和滴加的速度。滴加太快易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間。

  溫育的時(shí)間與溫度:

  溫育是ELISA測(cè)定中最容易出現(xiàn)問(wèn)題的步驟。溫育溫度應(yīng)在37℃,水浴。溫育時(shí)間應(yīng)按照試劑說(shuō)明書上的時(shí)間嚴(yán)格執(zhí)行。溫育實(shí)際測(cè)定操作中要注意以下幾點(diǎn):

  1)要保證在設(shè)定的溫度下有足夠的反應(yīng)時(shí)間。溫育時(shí)間不夠,弱陽(yáng)性樣本測(cè)不出來(lái)。

  2)因?yàn)椴捎盟。栽跍赜龝r(shí)一定要封板,防止水蒸氣形成水滴掉入反應(yīng)孔內(nèi)造成污染,并有可能整板花板。

  ELISA測(cè)定的洗板:

  全自動(dòng)洗板機(jī)的使用應(yīng)注意以下幾點(diǎn):

  1)洗板前,應(yīng)檢查洗液瓶、蒸餾水瓶是否充足,廢液瓶是否滿瓶

  2)在自檢過(guò)程中注意觀察洗液灌注是否通暢,排液是否通暢。

  3)在洗板過(guò)程中,應(yīng)注意觀察反應(yīng)孔每孔是否灌滿且無(wú)外溢,每孔吸水是否吸盡,并且要保證洗液在孔中放置的時(shí)間。

  BUNSEN本生提醒:ELISA測(cè)定以TMB為底物的顯色

  加入底物開(kāi)始顯色反應(yīng)前,最好是先檢查一下底物溶液的有效期。滴入A、B顯色劑后,需溫育15min,最后加入終止液終止反應(yīng),振蕩混勻后即可進(jìn)行下面的比色測(cè)定判斷結(jié)果。在此過(guò)程中應(yīng)注意不要把顯色劑和終止液滴入順序弄反,否則重做實(shí)驗(yàn)。

  ELISA的比色測(cè)定

  ELISA的比色測(cè)定由酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定,故需強(qiáng)調(diào)比色測(cè)定時(shí),一定要注意酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)是否是雙波長(zhǎng)(450nm和630nm)。

  ELISA測(cè)定結(jié)果判定

  結(jié)果判定一般是根據(jù)比色結(jié)果和肉眼觀察綜合判定。如在判定過(guò)程發(fā)現(xiàn)有些反應(yīng)孔出現(xiàn)倒陰不陽(yáng)的現(xiàn)象或出現(xiàn)不常見(jiàn)的模式(如乙肝兩對(duì)半中出現(xiàn)12陽(yáng)性等),需本著嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度,重新復(fù)查。

  對(duì)ELISA測(cè)定中出現(xiàn)問(wèn)題的可能原因(非試劑盒本身的原因),總結(jié)如下:

  1)弱陽(yáng)性質(zhì)控樣本檢測(cè)不出溫育的時(shí)間或溫度不夠;顯色反應(yīng)時(shí)間太短;所用配制緩沖液的蒸餾水有問(wèn)題。

  2)測(cè)定的重復(fù)性差,這是由于測(cè)定操作引起的問(wèn)題,包括

  ①加樣本及試劑量不準(zhǔn);孔間不一致

  ②加樣過(guò)快,孔間發(fā)生污染

  ③加錯(cuò)樣本

  ④加樣本及試劑時(shí),加在孔壁

  ⑤不同批號(hào)試劑盒中組分混用

  ⑥溫育時(shí)間、洗板、顯色時(shí)間不一致

  ⑦孔內(nèi)污染雜物,

  血清標(biāo)本未凝固即加入,反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血細(xì)胞,易出現(xiàn)假陽(yáng)性等。

  3)全部孔都不顯色

  ①漏加酶結(jié)合物;

  ②洗板液配制中出現(xiàn)問(wèn)題

  ③漏加顯色劑A或B

  ④終止劑當(dāng)顯色劑使用

  4)全部板孔均有顯色

  ①板不干凈

  ②顯色液變質(zhì)

  ③洗板液受酶等污染

  ELISA試劑盒 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命,追求企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力的不斷提升。公司在經(jīng)營(yíng)中始終秉承:遵紀(jì)守法,嚴(yán)于律己,寬仁以待,敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn),以過(guò)硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來(lái)維護(hù)和拓展市場(chǎng),較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏,是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們?cè)概c您真誠(chéng)合作,共創(chuàng)美好的未來(lái)。


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